Представляет собой готовую к использованию среду, в состав которой входят все необходимые вещества для культивирования лимфоцитов цельной крови. Предназначена для культивирования лимфоцитов крови in vitro с целью получения делящихся клеток и последующего анализа метафазных хромосом.
Данный продукт имеет Регистрационное Удостоверение.
Среда «Лимфокар-2» является вспомогательным средством в диагностике возможных патологических нарушений на генетическом уровне. Используется для диагностики in vitro (кариотипирования) – для культивирования лимфоцитов крови in vitro и последующего цитогенетического анализа метафазных хромосом с вычислением митотического индекса.
Анализ осуществляется с помощью микрометода культивирования лимфоцитов периферической крови человека и приготовления препаратов метафазных хромосом. Для анализа используется гепаринизированная кровь.
Среда «Лимфокар-2» представляет собой готовую к использованию бессывороточную среду, в состав которой входят все необходимые вещества для культивирования лимфоцитов цельной крови: смесь неорганических солей, аминокислот, витаминов, глюкозы, фенолового красного, антибиотиков, а также ФГА-П и др.
Наличие в среде фитогемагглютинина-П (ФГА-П) в оптимальной для лимфоцитов человека концентрации, обеспечивает митогенный эффект среды. Остановка митотического деления с последующим накоплением метафазных пластин достигается инкубацией клеток с колхицином. В дальнейшем для проведения цитогенетического анализа клетки переводят в гипотонический раствор хлористого калия, фиксируют смесью метанола с ледяной уксусной кислотой.
Способ применения
Перед непосредственным применением среду следует разморозить. Размораживание должно происходить естественным путём в холодильной камере при температуре от +2 до +8°С. Запрещена ускоренная разморозка среды и оттаивание при температуре 37°С. Рекомендуется избегать многократных циклов замораживания-оттаивания. После размораживания и перемешивания среда представляет собой прозрачную жидкость красно-розового цвета.
Приступая к работе, содержимое каждого флакона аккуратно перемешать, путём бережного переворачивания флакона.
Вскрытие флакона и последующие манипуляции следует производить в асептических условиях.
Для культивирования 0,5 мл крови рекомендуется использовать 7 мл среды.
В стерильную ёмкость (флакон, пробирку и т.п.), вместимостью не менее 10 мл, в асептических условиях внести 7 мл среды.
Лимфокар-2 кат. №Н11 и №Н212 объёмом 60 и 100 мл необходимо перенести в стерильные ёмкости объёмом не менее 10 мл.
Лимфокар-2 кат. №Н10 выпускается в готовом для применения объёме 7 мл формате тест-флакона. Культивирование лимфоцитов производится непосредственно в тест-флаконе без переноса в другие ёмкости.
В ёмкость со средой внести 0,5 мл цельной гепаринизированной крови.
Стерильные ёмкости с тестируемыми образцами инкубировать в термостате при 37°С в течение 72 часов.
Растворить колхицин (0,1 мг/мл) в 5 мл дистиллированной воды. За 1,5 – 2 часа до окончания инкубации остановить деление клеток, путём добавления в каждую ёмкость с культурой клеток (тест-флакон, пробирку) - по 50 мкл водного раствора колхицина.
Через 1,5–2 часа после добавления колхицина ёмкость встряхнуть, и перенести её содержимое в центрифужную пробирку. Клетки осадить центрифугированием в течение 5-7 мин при 1000-1500 об/мин.
Приготовить гипотонический раствор хлористого калия (0,075 М), растворением 0,56 г KCl в 100 мл дистиллированной воды. Раствор подогреть до 37°С.
После центрифугирования супернатант удалить, осадок разбить и в пробирку добавить 10 мл подогретого гипотонического раствора KCl. Хорошо перемешать осадок и поместить пробирку в термостат, инкубировать при 37°С в течение 10-12 мин.
Обработанные клетки осадить центрифугированием в течение 5-7 мин при 1000-1500 об/мин.
Супернатант отобрать и удалить, оставляя 0,5-1,0 мл надосадочной жидкости, и энергичным встряхиванием ресуспендировать клетки.
Далее проводится фиксация клеток свежеприготовленной смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1. В пробирку, содержащую суспензию клеток добавить резкой струей фиксирующий раствор (2-3 мл), и довести объём в пробирке до 6-8 мл. Разбить осадок и поставить пробирку в холодильник на 5-10 минут.
Обработанные фиксирующим раствором раствором клетки необходимо центрифугировать при 1000-1500 об/мин в течение 5-7 мин. Супернатант удалить, к осадку добавить 8-10 мл охлаждённого фиксирующего раствора. Разбить осадок. Далее выдержать при 4°С в течение 15-20 мин, поместив в холодильник.
Обработанные фиксирующим раствором клетки центрифугировать при 1000-1500 об/мин в течение 5-7 мин. Супернатант удалить. Повторить фиксацию и обработку клеток свежеприготовленной смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 (в пробирку с суспензией клеток добавить фиксирующий раствор (2-3 мл), и довести объём в пробирке до 6-8 мл). Разбить осадок и поставить пробирку в холодильник до окрашивания тестируемых образцов.
Обработанные клетки осадить центрифугированием в течение 5-7 мин при 1000-1500 об/мин. Супернатант удалить. Осадок ресуспендировать в 0,5-1,0 мл фиксирующего раствора и раскапать суспензию на охлажденные, смоченные водой предметные стёкла. Затем с целью фиксации стёкла быстро провести над пламенем горелки или высушить при комнатной температуре.
В заключении препараты подвергают искусственному «старению» и окрашивают, используя краситель Гимза (или другой краситель, с аналогичными характеристиками) по общепринятой методике.
Данная Инструкция разработана на основе рекомендаций по приготовлению хромосомных препаратов (Методическое пособие для врачей «Цитогенетические методы диагностики хромосомных болезней», М. ,2009).
Форма выпуска
Препарат выпускают в пластиковых флаконах (ПЭТ-таре) по 7, 60 или 100 мл, которые герметично укупорены. Еврофлаконы имеют широкое, удобное для работы горло.
Срок годности: 2 года.
Срок годности изделия после первичного вскрытия флакона составляет 1 месяц с даты вскрытия при температуре от +2 до +8°С.
Хранить в защищенном от света месте при температуре от –10 до –20°С.
Написать отзыв