Набор представляет собой систему из 2 реагентов на основе D-люциферина, использующуюся для количественного определения люциферазы светлячка (Firefly luciferase), которая является одним из наиболее чувствительных инструментов для анализа экспрессии генов.
Характеристики
Данный продукт представлен в виде 2 отдельных реагентов:
1) буфер для анализа (реагент #1) 2) субстрат люциферазы светлячка – Firefly luciferase (реагент #2)
Репортерные гены часто используются в клеточной биологии для изучения экспрессии генов и других клеточных явлений, таких как активность рецепторов, передача внутриклеточного сигнала, процессинг мРНК, фолдинг белков и белок-белковые взаимодействия. Люциферин – природное соединение, выделенное из светлячков, хемилюминесценция которого при 560 нм возникает в результате АТФ-зависимого процесса преобразования химической энергии его окисления через электронный переход с образованием молекулы оксилюциферина. Люцифераза светлячка (мономерный белок с молекулярной массой 61 кДа) катализирует окисление люциферина с использованием АТФ и Mg2+ в качестве косубстрата. Люцифераза светлячка (Firefly luciferase) нашла широкое применение в качестве репортера благодаря тому, что фермент становится активным сразу после трансляции, не требуя посттрансляционного процессинга, а также имеет самую высокую квантовую эффективность среди всех хемилюминесцентных реакций. Люцифераза кодируется геном luc, который широко используется в качестве репортерного гена в различных клеточных линиях. Из-за низкого фона, присущего методу хемилюминесценции, обнаружение экспрессии гена luc может быть выполнено на очень низком уровне.
Визуальный протокол
Протокол приготовления рабочего раствора
Перед проведением анализа требуется приготовить рабочий раствор, для чего необходимо аккуратно добавить весь объем буфера для анализа люциферазы (реагент #1) в лиофилизированный субстрат на основе D-люциферина (реагент #2). Перемешивать переворачиванием до полного растворения субстрата. Полученный готовый рабочий раствор (3Х) необходимо немедленно разаликвотить, заморозить и хранить при температуре –80°С в защищенном от света месте.
Протокол использования для 96-луночных микропланшетов
Для количественного определения люциферазы, экспрессируемой клетками, в каждую лунку 96-луночного планшета необходимо аккуратно добавить 80 мкл рабочей ростовой среды (например, DMEM, RPMI и др), стараясь не повредить клетки. Далее в каждую исследуемую лунку добавить 40 мкл готового рабочего раствора (3Х) AbiLux Firefly Luciferase Assay Kit, приготовленного раннее. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 минут до полного лизиса клеток. Провести измерение интенсивности люминесценции.
Условия хранения
Буфер для анализа люциферазы (реагент #1) и лиофилизированный субстрат на основе D-люциферина (реагент #2) – необходимо хранить в защищенном от света месте при температуре –20°С. Готовый рабочий раствор после смешения реагентов #1 и #2 необходимо хранить строго в защищённом от солнечного света месте при температуре –80°С в течение 6 месяцев, либо при температуре –20°С не более месяца.
Фасовка: 100 мл
Набор для анализа люциферазы AbiLux Firefly, 100 мл (арт. LUX-011-3-100ML) Отзывы:
Написать отзыв