В набор реагентов Stem-Kit входят реагент с мышиным моноклональным антителом, меченым двухцветным флуоресцентным красителем (FITC, PE), контрольный мышиный изоклон, меченый двухцветным флуоресцентным красителем (FITC, PE), реагент абсолютного количества, реагент жизнеспособности и реагент для лизирования. Набор предназначен «Для in vitro диагностики» для одновременной идентификации и подсчета процентного содержания и абсолютных количеств популяций клеток CD45+ и двойственно-положительных клеток CD45+ CD34+ в биологических образцах методом проточной цитометрии. В число биологических образцов входят образцы свежей нормальной или мобилизованной периферийной цельной крови, и образцы свежих либо оттаянных продуктов афереза, пуповинной крови или костного мозга. Измерения популяций клеток можно производить либо автоматизированным методом сортировки и анализа, либо вручную.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Гемопоэтические клетки-предшественники (HPC)
Реагенты Stem-Kit разработаны для идентификации человеческих гемопоэтических клеток-предшественников (HPC), причем для этой процедуры установлены следующие критерии: «истинные клетки CD34+ (а) экспрессируют антиген CD34, (b) экспрессируют антиген CD45 с характеристиками окраски, соответствующими бластным клеткам (то есть клетки легко распознаются, но на более низких уровнях, чем лимфоциты и моноциты), и (с) выявляют характеристики рассеяния бластных клеток с малым боковым углом и с передним углом, значение которого находится в диапазоне от малого до среднего» (1). Краситель 7-AAD, разработанный для выявления жизнеспособности, позволяет исключать мертвые CD34+ HPC из числа подсчитанных CD34+ HPC (2).
CD34 Антиген CD34 представляет собой семейство дифференциально гликозилированных трансмембранных одноцепочечных гликопротеинов I типа. (3, 4, 5). Он экспрессируется практическими всеми гемопоэтическими клетками-предшественниками, включая мультипотентные стволовые клетки. Эпитопы CD34 разделены на три класса в зависимости от чувствительности к нейраминидазе и к гликопротеазе Pasteurella haemolytica (6). Моноклональному антителу (mAb) CD34, вошедшему в комплект реагентов Stem-Kit, присвоено обозначение 581. Он специфическим образом распознает эпитопы III класса молекул CD34 (7), что определяется схемой ферментативного расщепления (6, 8). Моноклональное антитело 581 было признано специфичным в отношении антигена CD34 во время 5th HLDA Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens (5-й семинар, посвященный дифференцирующим антигенам лейкоцитов человека), проходившем в 1993 г. в Boston, Massachusetts, USA (США) (7).
CD45 Антитело CD45 распознает членов семейства CD45 пан-клеточных лейкоцитарных антигенов, молекулярный вес которых составляет 180, 190, 210 и 220 кДа (9, 10, 11). Он также известен, как общий лейкоцитарный антиген (LCA). Антиген CD45 экспрессируется на гемопоэтических клетках любого типа за исключением зрелых эритроцитов и их непосредственных предшественников (11, 12). В дифференцированных негемопоэтических тканях (12, 13, 14, 15) он обнаружен не был. Моноклональное антитело CD45 mAb, входящее в комплект реагентов Stem-Kit, носит обозначение J33. Оно было присвоено антигену CD45 во время 3rd HLDA Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens (3-й семинар, посвященный дифференцирующим антигенам лейкоцитов человека) в Oxford, Англия, в 1986 году (16).
7-AAD Краситель для определения жизнеспособности 7-амино-актиномицин D (7-AAD) является аналогом актиномицина D, содержащим замещенную аминогруппу в 7-й позиции хромофора. Краситель для определения жизнеспособности 7-AAD интеркалирует между цитозиновым и гуаниновым основаниями ДНК (15). Актиномицины являются биологически активными соединениями, содержащими хромофор 2-амино-4, 6 диметилфеноксазона-3 и два циклических пентапептида (17). Актиномицины образуют стабильные комплексы с двухцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), но ни с двухцепочечной рибонуклеиновой кислотой (РНК), ни с гибридами РНК-ДНК, ни с одноцепочечными РНК и ДНК они этих комплексов не образуют (15, 18). Спектральные свойства красителя 7-AAD, разработанного для выявления жизнеспособности, делают эту молекулу особенно подходящей для анализа средствами проточной цитометрии (17). Максимальное значение абсорбции комплекса 7-AAD / ДНК достигается в зеленом регионе спектра, и таким образом, оно оказывается подходящим для цитометров, снабженным аргоновым лазером (длина волны возбуждения составляет 488 нм) (15). Ввиду испускания красителем 7-AAD, предназначенным для определения жизнеспособности (от 635 до 675 нм), темно-красной флуоресценции, использовать эту пробу будет проще в сочетании с антителами, конъюгированными с флуоресцинизотиоцианатом (FITC) и с фикоэритрином (PE), потому что в отличие от пропидиум иодида (PI), комплекс 7-AAD / ДНК дает минимальное спектральное перекрытие с FITC и PE (17). При анализе жизнеспособных клеток с помощью проточной цитометрии апоптотические, некротические клетки, а также поврежденные клетки являются источником интерференции. Нежизнеспособные клетки следует оценивать и выделять, прибегая к 7-AAD-позитивному окрашиванию, когда жизнеспособные клетки остаются неокрашенными (отрицательный признак) (19).
Системы проточных цитометров В системах проточной цитометрии (FC 500) принципы проточной цитометрии применяются при анализе биологических образцов с тем, чтобы на основе используемых в ходе теста специфических моноклональных антител, поведение которых анализируется с помощью флуорохромов, идентифицировать различные клеточные популяции. Для анализа проб в ходе настоящего теста используются системы проточной цитометрии FC 500, снабженные программным обеспечением системы CXP.
ПРИНЦИП РАБОТЫ
Настоящий тест зависит от способности моноклональных антител связывать поверхность клеток, экспрессирующих дискретные антигенные детерминанты. Реагент CD45-FITC / CD34-PE из набора реагентов Stem-Kit является комбинацией двух мышиных моноклональных антител; каждое из них конъюгировано со специфическим флуорохромом и является специфичным для своего антигена на клеточной поверхности. К специфическому окрашиванию клеточной поверхности добавляется инкубация дублирующей пробы биологического образца с помощью двухцветного реагента CD45-FITC / CD34-PE. В порядке дополнительного теста та же проба окрашивается реагентом CD45-FITC / IsoClonic Control-PE для определения реакции неспецифического связывания с моноклональными антителами к антигену CD34-PE. Краситель жизнеспособности 7-AAD, который является красителем нуклеиновой кислоты и связывает доступные пары оснований (клеточные ДНК), используется для того, чтобы отличать жизнеспособные клетки от нежизнеспособных. Эритроциты в каждой пробе подвергаются лизису с помощью лизирующего раствора NH4Cl, приготовленного в концентрации 1X. Добавляются флуоросферы Stem-Count или Flow-Count (реагенты для определения абсолютного количества), а оставшиеся клетки анализируются в проточном цитометре. Контроль процесса и контроль качества в ходе проведения испытания обеспечиваются специальными реагентами для контроля за инструментом и для контроля за качеством проб: флуоросферами Flow-Check, флуоросферами Flow-Set или подходящими компенсационными реагентами, а также Stem-Trol Control Cells.
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКИХ ОБЛАСТЕЙ ПРИМЕНЕНИЯ
Как показывает история, первые научные исследования, посвященные гемопоэтическим клеткам-предшественникам (HPC), основывались на подсчете ядросодержащих клеток с целью количественного определения. Последующие исследования, включавшие в себя анализ колониеобразующих единиц (КОЕ), давали грубое приближение популяций клеток-предшественников. На смену анализу КОЕ, сопряженному с большими временными затратами, пришло открытие молекул поверхности клеток CD34. Как выяснилось, CD34 присутствует на поверхности ранних гемопоэтических клеток, а также на поверхности колониеобразующих клеток в костном мозге и в периферической крови (20). Затем были выведены моноклональные антитела, направленные против молекул CD34; они нашли себе применение в проточной цитометрии. Определение CD34 средствами проточной цитометрии в настоящее время получило широкое признание в качестве метода количественного анализа гемопоэтических клеток-предшественников и стволовых клеток. У обычного индивида от 1 до 3% клеток костного мозга, экспрессирующих антиген CD34, в состоянии восстановить долгосрочный мультилинейный гемопоэз (3, 20). В периферической крови обычного индивида антиген CD34 выделяется менее чем 0,1% циркулирующих клеток (1, 21). Использование реагентов Stem-Kit обеспечивает простой, быстрый и высокочувствительный метод цитометрии для подсчета гемопоэтических клеток-предшественников и стволовых клеток в периферической крови, продуктах лейкофереза, костном мозге и пуповинной крови.
1. Эти реагенты следует использовать как единый комплект, именно так, как они выпускаются. При использовании специфических концентраций, установленных в целях исследования, для определения абсолютных количеств можно применять флуоросферы Flow-Count, эквивалентные флуоросферам Stem-Count.
2. CD45-FITC / CD34-PE — это готовый к употреблению двухцветный реагент, поставляемый в натрий-фосфатном буферном растворе (PBS) объемом 2,2 мл с альбумином бычьей сыворотки (BSA) содержанием 2 мг/мл и 0,1%-ным азидом натрия в качестве консерванта.
3. CD45-FITC / IsoClonic Control-PE — это готовый к употреблению двухцветный реагент, поставляемый в натрий-фосфатном буферном растворе объемом 1,2 мл с альбумином бычьей сыворотки содержанием 2 мг/мл и 0,1%-ным азидом натрия в качестве консерванта. Реагент CD45-FITC / IsoClonic Control-PE представляет собой смесь неконъюгированных и конъюгированных фикоэритрином (идентичных CD34) моноклональных антител 581. Это смесь является подходящим средством изоморфологического контроля, позволяющим проверить наличие неспецифического связывания CD34-PE mAb в каждой пробе. ЗАМЕЧАНИЕ: Реагенты CD45-FITC / CD34-PE и CD45-FITC / IsoClonic Control-PE разделять нельзя. При проведении тестов и контрольных измерений необходимо следить за тем, чтобы у обоих реагентов на этикетке флакона был один и тот же номер серии.
4. Флуоросферы Stem-Count и Flow-Count состоят из полистирольных флуоресцирующих микросфер диаметром 10 мкм (номинальный диаметр), погруженных в 20 мл водной суспензионной среды, содержащей сурфактант и 1% формальдегида. Каждая калибровочная частица содержит краситель с диапазоном флуоресценции от 525 нм до 700 нм при возбуждении волной на 488 нм. Оцениваемая концентрация флуоросфер Stem-Count или флуоросфер Flow-Count (число флуоросфер в 1 мкл) выводится по результатам многократных параллельных испытаний в анализаторе размеров частиц COULTER. Значение для каждой серии указано на этикетке флакона.
5. Краситель жизнеспособности 7-AAD выпускается в 99-процентном натрий-фосфатном буферном растворе (PBS: 0,01 M фосфат натрия, 0,145 M хлорид натрия, pH 7,2) с добавлением 1%-ного диметилсульфоксида (DMSO).
6. Лизирующий раствор NH4Cl Lysing Solution выпускается во флаконах вместимостью 20 мл в десятикратной концентрации. Он содержит смесь хлорида аммония (NH4Cl), бикарбоната калия (KHCO2) и двунатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).
Набор рассчитан на 50 тестов.
Регистрационное удостоверение Росздравнадзора
Цена на данный товар может отличаться от заявленной на сайте – окончательную стоимость, информацию по наличию или срокам поставки можно уточнить, отправив заявку на info@laborant-med.ru
Набор конъюгатов антител для определения стволовых клеток Stem-Kit (Stem-Kit Reagents), 50 тестов (арт. IM3630) Отзывы:
Написать отзыв